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良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记进程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。

2、酶标抗体标记效果测定：

测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值和结合率。

（1）结合物的定量测定 一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于40 nm和280nm进行测定，然后按下列公式计算：

酶量（mg/ml）=OD40 ×0.42

IgG量（mg/ml）=（OD280——OD40 ×0.4）×0.94×0.62

对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量，按下列公式计算：

IgG量（mg/ml）=（OD280——OD40 ×0. 4）×0.62

已知酶量和IgG量后，即可计算出标记抗体的摩尔（mol）比值。

HRP/IgG摩尔比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4

结合物中酶总量=HRP（mg/ml）×结合物溶液量

结合物产率=结合物中酶总量/标记时加入的酶量×100%

2、基本原理

酶免ELISA试剂盒基本原理是酶分子与抗体或抗抗体份子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现色彩反应。因此，可通过底物的色彩反应来判定有没有相应的免疫反应，色彩反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA(酶联免疫吸附实验,酶联免疫试剂盒)检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，ELISA(方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

3、用于标记的酶

用于标记抗体或抗抗体的酶须具有以下特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。目前运用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。

1、辣根过氧化物酶（HRP）过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由 00个氨基酸组成，等电点为pH -9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和40 nm。

酶的纯度以RZ表示：RZ=OD40 /OD275

2、碱性磷酸酶系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，便宜无毒性。酶解产物呈黄色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中， 7℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。

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